植物線粒體DNA提取試劑盒

 一，試劑盒組份

二，保存條件

本試劑盒整體保存于2-8℃一年，DNASE I -20℃保存。使用前，在DNase I中加入600ul（50T）或者1200ul（100T）的DNA酶反應(yīng)液，分裝后-20℃保存三個(gè)月，如果超過三個(gè)月，活性可能會(huì)降低，請自行訂購DNASE I。線粒體裂解液使用前常溫保存，如有沉淀可37℃水浴溶解，不影響使用。

三，說明

線粒體DNA提取的關(guān)鍵是盡可能的去掉核DNA。本試劑盒利用差速離心得到比較純凈的線粒體，再利用DNA酶消化和裂解緩沖系統(tǒng)等多步驟去掉核DNA，zui后得到純凈的線粒體DNA。可用于PCR等對純度要求較高的實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒用于從植物葉片中分離出完整而純化的線粒體。適合于田間采摘或者實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的植物葉片中線粒體DNA的提取制備。

四，操作步驟

準(zhǔn)備工作：在DNASE I中加入600ul（50T）或者1100ul（100T）的DNA酶反應(yīng)液，適當(dāng)分裝后-20℃保存。線粒體裂解液保存于常溫，如有沉淀37℃水浴溶解，離心機(jī)溫度下降到4℃（2-8℃），如無低溫離心機(jī)，也可以常溫離心，并將離心時(shí)間為10min的改為5min，但zui后所得DNA品質(zhì)及產(chǎn)量可能會(huì)有一定影響。

1. 樣本采集前處理：無論田間自然生長還是實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)，采摘前須避光生長24-48小時(shí)，以減少葉片組織中糖類及葉綠體含量。取適量植物細(xì)胞裂解液，加入0.5% β-巰基乙醇，10ml 植物細(xì)胞裂解液加入50ulβ-巰基乙醇，混勻，形成植物細(xì)胞裂解液/β-巰基乙醇溶液，此溶液可2-8度保存一個(gè)月。

2. 葉片用蒸餾水清洗2-3次，濾紙吸干，有條件請用液氮研磨葉片1-2克，研磨完后，取800mg左右研磨的葉片粉，加入1.5ml預(yù)冷的植物細(xì)胞裂解液/β-巰基乙醇溶液，混勻。如果無條件（無液氮），請預(yù)冷研缽，取洗過的葉片1000 mg，用剪刀剪為碎塊放入玻璃勻漿器或者研缽中。加入1.5ml預(yù)冷的植物細(xì)胞裂解液/β-巰基乙醇溶液，冰上研磨至看不見明顯組織塊；

3. 將研磨物放置合適的離心管，4℃，1000× g 離心5 min；

4. 將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，在沉淀中加入0.5ml Lysis Buffer/β-巰基乙醇溶液，混勻，再次4℃，1000× g 離心5 min，取上清；合并兩次上清，將上清4℃ 1000× g 再次離心5 min。

5．取上清，加入一新的離心管中，4℃， 16,000 × g 離心10 min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，線粒體沉淀在管底。

6. 在線粒體沉淀中加入0.5 mL  Wash Buffer重懸線粒體沉淀，4℃，1000× g 離心5 min；

7．取上清，加入一新的離心管中，4℃， 16,000 × g 離心10 min。棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底；

8. 加入100ul DNA酶反應(yīng)液重懸線粒體，吹打均勻后，再加入10ul DNASE I溶液（見準(zhǔn)備工作），混勻，37℃水浴10min。此步為消化線粒體表面吸付的核DNA。4℃， 12,000 × g 離心5 min。盡可能的棄上清，再加入200ul TE 重懸線粒體沉淀，4℃，12,000 × g 離心5 min，洗去殘留的DNA酶。

9.得到的沉淀，用200ul TE緩沖液重懸線粒體沉淀，加入10ul  RNase A。加入200ul線粒體裂解液，輕輕混勻（不可吹打），放置1-2min，再加入150ul蛋白沉淀液，迅速混勻。4℃， 12,000 × g 離心5 min。此步驟可進(jìn)一步去除核DNA。

10．取上清，加入一新的離心管中（如用于酶切分析，可加入此步：選用等體積的酚氯fang異戊醇25:24:1抽提一次，再用氯fang抽提一次，或者直接用氯fang抽提兩次，一般來說，此步可去掉一些微量蛋白及糖類，但會(huì)造成線粒體DNA的損失，因而用于PCR時(shí)可省，并不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)），加入0.6倍體積的異丙醇（如無異丙醇，可加入2.5倍體積的乙醇沉淀DNA，如離心管太滿可分兩管）及5-10ul核酸核酸助沉劑，混勻，-20℃沉淀半小時(shí)左右（此步可?。?，4℃， 12,000 × g 離心10 min。

11. 棄上清，再加入1ml  70%乙醇清洗，4℃， 12,000 × g 離心5min。重復(fù)用70%乙醇洗一次。

12. 棄上清，再次離心1min 吸棄上清，不要碰到管底，開蓋涼干約5-105min。

13．加入20-30ul TE緩沖液,輕彈管底，37℃水浴5分鐘，線粒體DNA溶解。

14. 進(jìn)行DNA電泳檢測及-20℃保存，進(jìn)行下步的實(shí)驗(yàn)。

四 注意事項(xiàng)：
1. 以離心力g計(jì)算正確的離心速度，不同的離心機(jī)可據(jù)此精確計(jì)算離心速度。
2. 進(jìn)行Western Blot和2D-膠電泳，可直接在第7步的沉淀中加入上樣緩沖液裂解線粒體。

3. β-巰基乙醇有毒，請注意通風(fēng)及防護(hù)

一般低溫度心機(jī)都有離心力顯示，如果沒有，可以用以下公式簡單的換算。

G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]^２
G為離心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍數(shù)來表示；

 [rpm] ^２即：轉(zhuǎn)速的平方； R為半徑，單位為厘米。